钛具有良好的生物相容性和力学性能，已广泛应用于牙种植、整形等医学领域。但钛是生物惰性材料，需要对其表面进行仿生化修饰，才能达到加速愈合，提高骨结合率的目的。钛表面仿生化修饰的方法种类繁多，其中表面引入纳米膜层是最常用的方法。制备纳米膜层的方法包括:L-B膜(Langmuir-Blodgett film)技术、旋涂法(spin coating)、离子溅射法(spraying)、化学沉积法(chemical deposition)、电沉积法(electrodeposition)以及层层自组装(layer-by-layer assembly,LbL)技术。关于层层自组装技术的近年研究较多，其在生物科学中主要应用于酶、蛋白质、DNA等生物分子自组装膜。这些生物分子自组装膜被广泛应用于医用生物材料领域，成为实现生物材料表面功能设计的有效手段[1]。现就层层自组装技术的概念及特点、钛表面聚电解质膜的结构以及影响聚电解质膜形成的因素及应用进行综述。
一、层层自组装技术的概念
Decher和Hong[2]于1991年提出层层自组装技术，即基于静电相吸原理，聚电解质阴阳离子间相互作用而产生的自我组装技术，其所形成的多层膜也称聚电解质多层膜(polyelectrolyte multi-layer films,PEM)。具体而言即为将带电荷的基材表面连续交替浸没于带相反电荷的电解质溶液中，利用静电相吸作用，使带不同电荷的两种物质有序而紧凑地连接在一起，重复数次得到多层膜结构[3]。这种技术可在分子水平上改变钛表面性质，为钛表面改性提供新途径。
聚电解质膜具有如下特点:①能将蛋白质、多聚糖、磷脂、DNA等功能性物质固定于钛金属表面[4-8]；实现表面装载生物因子的缓释[9]。②制备工艺简单、温和、无需特殊设备，不受基材形状的限制。③制备的薄膜具有良好的力学和化学稳定性；薄膜的组成和厚度可控。
二、钛表面聚电解质膜的组成
钛表面经层层自组装技术制备的聚电解质膜可分为基底层、引发层、正负电荷聚电解质层。
1.钛表面碱性碳酸盐基底层
钛表面缺乏用于自组装的正负电荷，需用强酸、强碱或碱热等各种处理引入足够的正或负电荷。碱热处理是使钛表面带负电荷的经典方法[10]：羟基与水合氧化钛反应形成表面带负电荷的碱性钛酸盐水凝胶层，加热后水凝胶层去水化形成致密稳定的碱钛晶体层，其表面的负电荷即可用于后续的聚电解质层层自组装。此外，经碱热处理后，钛表面形成的水凝胶层具有纳米微孔，可提高比表面积，以组装更多的聚电解质。
2.引发层
已有研究认为，在带负电荷的碱热处理后的钛表面引入一层稳定的带正电荷聚电解质层作为引发层，可引发弱电解质的有序吸附[11-12]。常作为引发层的聚电解质有聚赖氨酸、聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)、壳聚糖等。
3.聚电解质层
聚电解质有不同分类方法。根据聚电解质所带电荷不同，可分为带正或负电荷的聚电解质。根据来源可分为人工合成和天然聚电解质。人工合成类主要有：聚二烯丙基二甲基氯化铵[poly(dimethyldiallylammonium chloride),PDDA]、聚丙烯酸甲酯[poly(methacrylic acid),PMA]、聚苯乙烯硫酸盐[poly(styrenesulfonate),PSS]、聚丙烯酸(polyacrylic acid,PAA)、PEI等；天然类主要有：核酸、蛋白质、海藻酸盐、硫酸软骨素、多聚糖、肝素、透明质酸、壳聚糖、纤维素硫酸酯、葡聚糖硫酸酯、羧甲基纤维素[3]。钛表面层层自组装改性多采用生物相容性好的天然聚电解质。
(1)带正电荷的聚电解质
聚赖氨酸是一种阳离子聚氨基酸，多肽结构使其具有良好的生物相容性。聚赖氨酸含有大量氨基，去质子化后带正电荷，可通过离子相互作用吸附聚阴离子，因此能充当钛表面层层自组装中带正电荷的聚电解质层。已有研究显示，以聚赖氨酸作为钛表面基底层，通过静电相互作用引入肝素-胶原自组装膜，可显著提高钛表面的抗凝血性能[12]。
壳聚糖是一种直链阳离子多糖，由β-(1,4)糖苷单元连接组成，这些糖苷单元上还随机带有N-乙酰基结构，因而壳聚糖具有糖胺多糖和透明质酸的部分特点，有良好的生物相容性和低免疫原性[13]。许多研究证实壳聚糖是有效的、可控的基因载体。钛表面层层自组装改性，构建壳聚糖-质粒DNA(人骨形成蛋白)聚电解质膜，可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[14]。此外，壳聚糖具有抗菌作用，但机制并不十分清楚，有学者认为带正电荷的壳聚糖与带负电荷的微生物反应能起抗菌作用[15]。
胶原是一种两性电解质，在酸性条件下带正电荷，其是细胞外基质的框架结构，可借助细胞表面的特异性受体向细胞发出信号，通过细胞骨架或各种信号转导途径将信号传导至细胞质乃至细胞核，因此将胶原引入聚电解质膜中能提高细胞在材料表面的黏附、增殖、分化、迁移等。
(2)带负电荷的聚电解质
肝素是一种聚阴离子氨基多糖，也是细胞外基质的成分，可与多种生长因子结合，从而调控细胞行为[17]。已有研究显示，钛表面可成功构建壳聚糖-肝素多层聚电解质膜结构，并促进成骨细胞的黏附、生长、增殖和分化[18]。肝素涂层由于具有抗凝血性和强亲水性，适用作抗细菌黏附涂层[19]。
透明质酸是一种重要的糖胺多糖，在生理环境中多以阴离子形式存在，是构成细胞外基质组分的重要物质，对调控成骨相关细胞的行为，促进骨形成、骨整合具有重要作用。Picart等[20]通过激光共聚焦显微镜观察荧光染色的聚赖氨酸-透明质酸交替组装多层膜，发现聚赖氨酸可在层间交换生长，而透明质酸则始终保持固定的层状结构，这种聚电解质层的生长方式使多层膜的厚度呈现指数增长的性质。
三、钛表面聚电解质膜的生长特性及影响因素
1.钛表面聚电解质膜的生长特性
随着组装层数增长，聚电解质膜的质量和厚度有线性增长和指数增长两种方式：两种聚电解质间的相互作用仅限于层与层间的界面作用，不发生相互扩散，所形成的膜呈线性增长。这种膜生长速度较缓慢，形貌较光滑。强聚电解质和大部分弱聚电解质构建的聚电解质膜遵循这种线性增长方式，如DNA与聚盐酸烯丙胺、PEI、PDDA所形成的膜均呈线性增长方式[21]。聚电解质的相互扩散运动和穿透是指数增长型聚电解质膜的重要特征。这种膜生长速度较快，表面粗糙度较大。指数增长型多层膜大多出现于包含多糖或多肽的弱电解质体系中，与聚电解质的电荷密度密切相关[22]。指数增长型多层膜更稳定，并可载入更多的生物活性分子[23-24]。
2.影响钛表面聚电解质膜的形成因素
聚电解质膜生长的驱动力以静电吸引力为主。影响钛表面聚电解质膜生长和性能的因素较多，如聚电解质性质、相对分子质量、浓度、介质离子浓度和pH值、组装过程中温度、吸附时间和清洗等。改变这些参数，可以调节膜的生长速度以及生长方式，从而控制膜的厚度和物理性质。
每层膜对基质或另一层膜的吸附需要足够数量的离子键。典型静电吸附自组装过程中，聚电解质的质量浓度一般应＞1 g/L，随着聚电解质浓度的增加，单层膜的厚度也随之增加[25]。改变电解质介质中盐离子浓度和pH可以调节电解质电荷密度，从而调节电解质反应和膜的生长。改变溶液中盐离子浓度，可影响聚电解质在溶液中的构象，使电解质膜呈指数增长，增加膜厚度[26]。聚电解质液中离子强度的提高可以起屏蔽静电的作用，减弱正负强电解质分子间的相互吸引。也有研究显示，盐离子浓度过高也可导致盐离子在膜表面与电解质离子竞争或完全取代电解质离子，造成层层自组装失败[27]。目前盐离子浓度对聚电解质膜增长影响的机制并不十分清楚。
由于弱聚电解质的pH敏感性，调节pH即能控制聚电解质的电荷密度，影响聚电解质性质，调控发生吸附时聚电解质的构象，从而达到控制多层膜内部和表面的组分以及其他物理性质的目的。另外，调节pH可调节多层膜的离子交联程度，控制聚电解质膜的黏弹性，从而进一步控制聚电解质膜的弹性模量。
清洗步骤在组装过程中十分重要，其不仅可清除膜表面每次吸附后残留的液体、避免交叉污染，而且有助于已吸附的聚电解质层的稳定[28]。吸附时间的确定取决于聚电解质的相对分子质量、浓度以及搅拌操作[29]。
四、层层自组装技术在钛表面改性中的应用
1.钛表面的生物大分子固定
钛表面层层自组装改性是一种有效固化、传递治疗因子的方法。许多研究从细胞学、分子生物学角度证实：蛋白质、多糖类生物大分子在钛表面的固定，构建了稳定的类细胞外基质表面，具备良好的细胞相容性。目前报道的固定分子种类包括壳聚糖、胶原、生长因子、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白、釉原蛋白等。学者最早在钛表面制备壳聚糖-明胶聚电解质膜，以提高生物相容性[30]。Chua等[31]将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列以化学键固定于壳聚糖-透明质酸聚电解质膜，获得了良好的黏附性能，并证实其可促进成骨细胞在钛表面的黏附和增殖。纤连蛋白-壳聚糖在钛金属表面的自组装改性能亦可促进成骨细胞的增殖、活性、DNA合成和分化作用[4]。生物力学实验证实，钛种植体表面引入壳聚糖-透明质酸或壳聚糖-明胶层层自组装膜可提高种植体的固位稳定性[5]。
2.钛表面原位基因的释放
基于层层组装聚电解质和组装方式的多样性，多种阳离子如PEI、阳离子脂质体、环糊精可通过预组装和组装的方式引入基因涂层设计中。这种在生物材料表面构建的DNA-阳离子聚合物层状结构，不但可有效提高涂层的原位基因转染效率，同时可作为DNA的缓释储库，实现在钛植入部位精确定位释放DNA，对基因治疗有重要意义。已有研究证实，聚赖氨酸-DNA层层自组装改性，可有利于钛表面蛋白的吸附和生物矿化，有效提高钛表面生物活性[32]。钛表面的壳聚糖-DNA聚电解质膜可持续原位诱导前成骨细胞向成骨细胞分化[33]。壳聚糖、聚赖氨酸具有良好的生物降解性，含有质粒DNA的多层膜在生理条件下被酶降解，释放质粒DNA转染细胞，使细胞持续表达生物活性靶蛋白，从而达到治疗目的。
3.细胞生物学行为的调控
聚电解质多层膜可改变钛表面的物理化学性能，从而调控细胞生物行为。种植体植入后，细胞在钛表面的黏附是细胞生长、分化和繁殖的第一步，材料表面的物理化学性质是影响细胞黏附的主要因素。多项研究证实，层层自组装功能化改性的钛表面携带活性分子，能调控种植体表面细胞黏附、增殖、分化、生物行为[4,30,34-35]。但也有研究显示，钛合金(TiAl6V4)表面的低聚电解质膜对成骨细胞的增殖和分化无明显作用。
4.钛表面的抗菌作用
种植体表面抗菌，防止细菌膜形成是预防种植失败的有效方法之一。早期研究证实，在玻璃表面引入壳聚糖-透明质酸聚电解质膜后，可减少80%的肠杆菌黏附[37]。同样，钛表面的壳聚糖-透明质酸聚电解质膜能长时间保持钛表面抗菌性，减少种植感染概率[38]。用脂质体与天然聚电解质构建的载银离子聚电解质膜，也可达到长效抗菌的目的[39]。
种植体表面改性包括物理、化学、仿生化改性。种植体表面改性的趋势是表面仿生化改性，将生物大分子固定于种植体表面，促进骨整合。但生物大分子的固定、缓释控释和生物活性保持是表面仿生化改性的难点，层层自组装技术的优势在于其不但可在钛表面装载更多种类和数量的生物大分子，而且还可通过聚电解质膜的降解达到缓释控释的目的，同时组装流程简单可控并有优越的薄膜调控功能，因此，层层自组装技术是一种前景可观的钛表面改性方法。
目前钛表面形成聚电解质膜的驱动力多是经典的静电相互作用力，但氢键、共价键、配位键等自组装技术已引起越来越多的学者的重视。层层自组装技术的主要问题在于目前的研究均是针对自组装制备、结构、功能的研究，缺乏对聚电解质膜和自组装技术的机制研究。未来层层自组装技术的研究热点将从单纯生物分子活性固定、控释，转向模拟构建细胞外基质化学、物理和生物多元结构方向发展；同时层层自组装的组装机制及规律也是自组装技术研究的重要领域之一。
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（注，原文标题：聚电解质多层膜在钛表面改性中的应用）
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